假尿苷（Ψ）修飾研究：Ψ-seq、BID-seq、BACS與納米孔技術(shù)的全面對比
假尿苷 （ Ψ ） 修飾 是 RNA 中豐度最高的修飾之一，廣泛存在于 tRNA、rRNA、snRNA 及 mRNA 中，通過改變 RNA 的二 級結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或與蛋白的互作，調(diào)控翻譯效率、RNA 剪切等關(guān)鍵過程，在細(xì)胞應(yīng)激、發(fā)育及疾病中發(fā)揮核心作用。從早期的全轉(zhuǎn)錄組初篩，到臨床樣本的定量分析，再到高分辨率的密集位點(diǎn)解析，直至單分子層面的原生 RNA 探究，Ψ-seq/Pseudo-seq、BID-seq、BACS 與納米孔技術(shù)依次構(gòu)建起 Ψ 修飾研究的技術(shù)階梯。本文將介紹這四類主流技術(shù)的原理、實(shí)驗(yàn)流程及優(yōu)劣勢。
（一）Ψ-seq/Pseudo-seq
核心依賴 CMC（N - 環(huán)己基 - N'-(2 - 嗎啉乙基) 碳二亞胺甲基對甲苯磺酸鹽）特異性標(biāo)記 ：CMC 可與 RNA 中的 U、G 和 Ψ 形成加合物，經(jīng)堿性條件處理后，僅 Ψ-CMC 加合物穩(wěn)定保留，其余加合物被逆轉(zhuǎn)。Ψ-CMC 加合物會(huì)阻礙逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）前進(jìn)，導(dǎo)致 RT 在 Ψ 位點(diǎn)下游 1 個(gè)核苷酸處終止，通過高通量測序檢測這些終止位點(diǎn)，對比 CMC 處理組（+CMC）與未處理組（-CMC），篩選出 CMC 依賴的特異性終止信號，即為 Ψ 位點(diǎn)。
1.樣本制備與 RNA 提取：從釀酒酵母等樣本中提取總 RNA，通過 oligo (dT) 纖維素珠富集 poly (A)+ RNA（適配 mRNA 檢測）。
2.RNA 碎片化：用氯化鋅隨機(jī)斷裂 RNA 為 60-150 nt 片段，確保轉(zhuǎn)錄組均勻覆蓋。
3.CMC 標(biāo)記與加合物逆轉(zhuǎn)：+CMC 組用 0.5 M CMC 處理 RNA，-CMC 組用緩沖液替代；后續(xù)經(jīng)堿性條件孵育，去除 U-CMC 和 G-CMC 加合物，僅保留 Ψ-CMC。
4.文庫構(gòu)建：修復(fù) RNA 3' 末端環(huán)狀磷酸基團(tuán)，連接 3' 接頭，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，凝膠純化篩選截短 cDNA（對應(yīng) RT 終止產(chǎn)物），經(jīng)環(huán)化和 PCR 擴(kuò)增獲得測序文庫。
5.測序與數(shù)據(jù)分析：Illumina 平臺測序后，通過 barcode 拆分、 adapter 修剪、基因組比對，識別 + CMC 組特有的 RT 終止位點(diǎn)，確定 Ψ 在轉(zhuǎn)錄組中的位置。
1.首次實(shí)現(xiàn)全轉(zhuǎn)錄組 Ψ 位點(diǎn)定位，可發(fā)現(xiàn) mRNA、rRNA、tRNA 等多種 RNA 中的 Ψ 修飾，為 Ψ 功能研究奠定基礎(chǔ)。
2.達(dá)到單核苷酸分辨率，能精準(zhǔn)確定 Ψ 在 RNA 序列中的具體位置。
3.適配性廣，可調(diào)整流程用于不同物種（只要能獲得高質(zhì)量 mRNA）。
1.無絕對定量能力：僅能定性判斷 “是否存在 Ψ”，無法檢測修飾比例（如 30%、70%）。
2.樣本量需求高：需至少 2 μg poly (A)+ RNA，難以適配微量樣本。
3.流程繁瑣：涉及多步化學(xué)處理、凝膠純化，操作復(fù)雜度高，易導(dǎo)致 RNA 損耗。
4.存在假陽性風(fēng)險(xiǎn)：RNA 二級結(jié)構(gòu)等因素可能導(dǎo)致非特異性 RT 終止，需依賴多生物學(xué)重復(fù)（建議≥14 個(gè)）過濾。
5.無法區(qū)分連續(xù) U 中的 Ψ：對密集修飾區(qū)域的檢測效果受限，且不兼容低豐度 RNA 的精準(zhǔn)分析。
（二）BID-seq
中性 pH 條件下亞硫酸氫鹽可與 Ψ 定量反應(yīng)形成 Ψ-BS 加合物，且不引發(fā)胞嘧啶（C）脫氨基（避免序列復(fù)雜性丟失）。Ψ-BS 加合物會(huì)導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄酶（SuperScript IV）在修飾位點(diǎn)發(fā)生 “跳躍讀取”，使 cDNA 對應(yīng)位置出現(xiàn)堿基缺失；對比亞硫酸氫鹽處理組（+BS）與未處理組（-BS），篩選出 BS 依賴的特異性缺失信號，即為 Ψ 位點(diǎn)，且缺失率與 Ψ 修飾比例正相關(guān)，可實(shí)現(xiàn)定量。
1.樣本制備與 RNA 提取：從細(xì)胞或組織中提取總 RNA，富集 poly (A)+ RNA（適配 mRNA 檢測），僅需 10–20 ng 輸入 RNA。
2.RNA 預(yù)處理：將 RNA 片段化為適合測序的片段，修復(fù) 3' 末端環(huán)狀磷酸基團(tuán)，連接 5' 和 3' 測序接頭。
3.亞硫酸氫鹽修飾：+BS 組用優(yōu)化后的亞硫酸氫鹽試劑（2.4 M Na?SO? + 0.36 M NaHSO?）70℃孵育 3 小時(shí)，形成 Ψ-BS 加合物；-BS 組用緩沖液替代，作為對照。
4.文庫構(gòu)建：經(jīng)脫硫、逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA（SuperScript IV 酶），PCR 擴(kuò)增后純化測序文庫。
5.測序與數(shù)據(jù)分析：Illumina 平臺測序后，通過比對基因組、計(jì)算缺失率，結(jié)合校準(zhǔn)曲線（基于已知 Ψ 比例的合成 RNA），確定 Ψ 位點(diǎn)及修飾比例。
1.兼具單堿基分辨率與絕對定量能力：可精準(zhǔn)定位 Ψ 位置，同時(shí)通過缺失率計(jì)算修飾比例（如 10%、50%），解決傳統(tǒng)技術(shù)僅能定性的局限。
2.樣本量需求低：僅需 10–20 ng RNA，適配微量樣本（如臨床活檢組織、小鼠組織）。
3.序列復(fù)雜性保留：中性 pH 條件避免 C 脫氨基，不影響 RNA 序列完整性，減少 mapping 困難。
4.覆蓋范圍廣：可檢測 mRNA、rRNA、tRNA 等多種 RNA 的 Ψ 修飾，且能識別組織特異性 Ψ 位點(diǎn)。
1.特定序列背景存在干擾：部分含 ACΨ、CUΨ 等 motif 的未修飾 RNA 可能出現(xiàn) 10–25% 的背景缺失率，需通過嚴(yán)格篩選標(biāo)準(zhǔn)排除假陽性。
2.密集修飾區(qū)域檢測受限：相鄰 Ψ 位點(diǎn)可能因 “信號遮蔽” 導(dǎo)致低修飾比例位點(diǎn)漏檢。依賴校準(zhǔn)曲線：不同序列 motif 的 Ψ-BS 反應(yīng)效率有差異，需通過合成 RNA 探針構(gòu)建校準(zhǔn)曲線，增加實(shí)驗(yàn)復(fù)雜度。
（三）BACS
利用 Ψ 獨(dú)有的游離 N1 原子，與 2 - 溴丙烯酰胺發(fā)生加成反應(yīng)，隨后通過分子內(nèi) O2- 烷基化形成穩(wěn)定的 nce1,2Ψ 環(huán)化產(chǎn)物；未修飾的尿苷（U）因無游離 N1，無法發(fā)生該反應(yīng)，實(shí)現(xiàn) Ψ 的特異性標(biāo)記。nce1,2Ψ 產(chǎn)物在反轉(zhuǎn)錄（RT）過程中堿基配對特性改變，不再與腺嘌呤（A）常規(guī)配對，而是被反轉(zhuǎn)錄酶識別為胞嘧啶（C），最終在 cDNA 中產(chǎn)生U-to-C 的特異性突變信號，通過突變率可直接定量 Ψ 的修飾水平。
1.RNA 樣本預(yù)處理：提取總 RNA / 核糖體 RNA/PolyA+ RNA，經(jīng) DNase I 去除基因組 DNA 后，用鎂離子試劑將 RNA 片段化為 100-200 bp 短片段，再通過 T4 多核苷酸激酶修復(fù) RNA 3' 端，為接頭連接做準(zhǔn)備。
2.3' 接頭連接與純化：給修復(fù)后的 RNA 連接特異性 3' 接頭，用 5'- 脫腺苷酶和 RecJ 核酸酶清除多余游離接頭，純化獲得帶 3' 接頭的 RNA。
3.2 - 溴丙烯酰胺特異性修飾：將 RNA 與 250 mM 2 - 溴丙烯酰胺、625 mM 磷酸鹽緩沖液（pH8.5）混合，85℃孵育 30 分鐘，使 Ψ 發(fā)生環(huán)化修飾形成 nce1,2Ψ 產(chǎn)物，經(jīng)兩次純化去除未反應(yīng)試劑。
4.反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA：加入 RT 引物和 dNTP，通過反轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA；用 Exo I 消化多余引物，再用 NaOH 水解 RNA 模板并中和，純化得到 cDNA。
5.cDNA 接頭連接與 PCR 擴(kuò)增：給 cDNA 連接雙鏈接頭，進(jìn)行 10-12 個(gè)循環(huán)的 PCR 擴(kuò)增，純化后獲得可用于測序的文庫。
6.測序與數(shù)據(jù)分析：測序，結(jié)合 NNΨNN/NNUNN 合成 spike-in 校準(zhǔn)，通過公式計(jì)算 Ψ 修飾水平，同時(shí)識別 A-to-I 編輯和 m1A 修飾信號。
1.位點(diǎn)定位精準(zhǔn)：通過 Ψ-to-C 的單堿基突變信號，可精準(zhǔn)區(qū)分 連續(xù)尿苷序列 和 密集修飾區(qū)域 。
2.定量準(zhǔn)確性高：通過合成 spike-in 構(gòu)建校準(zhǔn)曲線，與金標(biāo)準(zhǔn) SILNAS 質(zhì)譜的定量相關(guān)性 r=0.90，且 256 種序列基序中 230 種的 Ψ 轉(zhuǎn)化效率＞85%。
3.多修飾同步檢測：可在同一文庫中同時(shí)檢測 Ψ、A-to-I 編輯和 m1A，實(shí)現(xiàn) “一庫多檢”，無需額外構(gòu)建多個(gè)文庫，降低樣本和試劑消耗。
1.樣本需求量較高：實(shí)驗(yàn)需 50-200 ng 的 rRNA 或 polyA+ RNA，對低起始量樣本（如微量臨床樣本）的兼容性不足，無法滿足單細(xì)胞或微量體液樣本的檢測需求。
2.化學(xué)處理存在 RNA 降解風(fēng)險(xiǎn)：85℃的高溫環(huán)化處理可能導(dǎo)致部分 RNA 片段降解，會(huì)輕微降低文庫構(gòu)建效率。
3.數(shù)據(jù)分析流程復(fù)雜：需結(jié)合 UMI 去重、基序特異性校準(zhǔn)、多修飾信號區(qū)分等步驟，對生物信息學(xué)分析能力要求較高，且需定制化腳本（依賴 GitHub 開源代碼），普通實(shí)驗(yàn)室難以快速復(fù)現(xiàn)。
（四）nanoRMS/NanoPsu
RNA 分子通過納米孔時(shí)，會(huì)產(chǎn)生特征性電流強(qiáng)度信號；Ψ 作為尿苷（U）的異構(gòu)體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)差異會(huì)導(dǎo)致兩種關(guān)鍵信號變化 —— 一是堿基識別（base-calling）時(shí)出現(xiàn)特異性 “錯(cuò)誤”（主要為 U→C 錯(cuò)配），二是電流強(qiáng)度和信號軌跡（trace）與未修飾 U 存在顯著差異。通過專用軟件（如 nanoRMS）提取單分子層面的電流強(qiáng)度、信號軌跡等特征，利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法（KNN 或 K-means）區(qū)分 “修飾讀段” 與 “未修飾讀段”，統(tǒng)計(jì)修飾讀段占比即可量化 Ψ 修飾比例；同時(shí)以敲除假尿苷合成酶（PUS）的菌株為對照，校準(zhǔn)信號特異性。
1.樣本制備與 RNA 提?。簭募?xì)胞或組織中提取總 RNA 或富集 poly (A)+ RNA（適配 mRNA 檢測），無需化學(xué)標(biāo)記或抗體富集，保留 RNA 原生狀態(tài)。
2.文庫構(gòu)建：對 RNA 進(jìn)行 poly (A) 尾修飾（若為非 poly (A) RNA），連接納米孔測序?qū)Ｓ媒宇^（RTA/RMX），形成 RNA:DNA 雜交鏈，無需 PCR 擴(kuò)增，避免引入偏倚。
3.納米孔測序：將文庫加載到 ONT MinION 等測序平臺，通過納米孔實(shí)時(shí)檢測 RNA 通過時(shí)的電流信號，獲取單分子層面的原始信號數(shù)據(jù)（FAST5 格式）。
4.數(shù)據(jù)分析：先用 Guppy 等工具進(jìn)行堿基識別（base-calling），篩選 Ψ 特有的 U→C 錯(cuò)配信號；再用 nanoRMS 軟件提取電流強(qiáng)度、信號軌跡等特征，通過機(jī)器學(xué)習(xí)模型區(qū)分修飾與未修飾讀段，最終輸出 Ψ 位點(diǎn)定位及修飾比例。
1.無需化學(xué)修飾或抗體：直接檢測原生 RNA，避免 CMC 標(biāo)記、亞硫酸氫鹽處理等步驟導(dǎo)致的 RNA 降解或偏倚，保留 RNA 天然修飾狀態(tài)。
2.單分子分辨率與定量能力：既能定位 Ψ 位點(diǎn)（單堿基分辨率），又能通過單分子讀段統(tǒng)計(jì)實(shí)現(xiàn)修飾比例定量（5%-100%），還可捕捉同一 RNA 分子上的多個(gè)修飾共存信息。
3.適配多種 RNA 類型：可檢測 rRNA、tRNA、mRNA、snRNA/snoRNA 等多種 RNA 的 Ψ 修飾，還能同步分析 2′-O - 甲基化（Nm）等其他修飾。
4.實(shí)驗(yàn)流程簡便：無需復(fù)雜文庫構(gòu)建步驟，避免 PCR 擴(kuò)增，縮短實(shí)驗(yàn)周期，且能處理完整長度的 RNA 分子，保留異構(gòu)體信息。
1.低豐度位點(diǎn)靈敏度不足：對 mRNA 等低豐度 RNA 中的低修飾比例位點(diǎn)（<10%）檢測難度大，需極高測序深度（≥50 M reads），增加實(shí)驗(yàn)成本。
2.序列背景依賴性：部分序列上下文（如連續(xù) U 或復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)區(qū)域）會(huì)干擾信號識別，導(dǎo)致假陽性或定位偏差，需結(jié)合其他技術(shù)驗(yàn)證。
3.數(shù)據(jù)分析復(fù)雜：依賴專用軟件和機(jī)器學(xué)習(xí)模型，需校準(zhǔn)堿基識別算法（如 Guppy）和映射工具（如 GraphMap），對生物信息學(xué)能力要求較高。
4.設(shè)備成本較高：需專用納米孔測序平臺（如 MinION），初期投入高于傳統(tǒng)測序技術(shù)，且低修飾比例位點(diǎn)的定量準(zhǔn)確性需依賴標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)。
下表是四種技術(shù)的對比：